Deteksi Kloramfenikol pada Rajungan Menggunakan Teknik ELISA

Trial ELISA kit Elabscience CAP-E-FS-E044

---

Rajungan dan Kloramfenikol

Rajungan termasuk salah satu hasil perikanan yang umumnya bersifat perishable food (mudah rusak/busuk). Pembusukan akan segera terjadi setelah hewan tersebut mati jika tidak dilakukan pengolahan dan penanganan pasca panen yang baik. Penurunan mutu pada daging rajungan terutama disebabkan oleh aktivitas enzim dan bakteri. Mikroorganisme penyebab kerusakan pada produk perikanan adalah bakteri, kapang, dan khamir. Organisme utama penyebab kerusakan pada produk perikanan adalah bakteri karena kondisi produk perikanan cocok untuk pertumbuhan bakteri (R, Rindi, 2018). 

Kloramfenikol adalah antibiotik spektrum luas yang efektif terhadap beberapa jenis bakteri dan kuman anaerob. Kloramfenikol merupakan salah satu dari sembilan jenis bahan tambahan makanan yang dilarang di Indonesia. Uji kloramfenikol dilakukan pada raw material dan finish produk. Pengujian kloramfenikol dilakukan menggunakan metode ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) diawali dengan preparasi sampel sebelum dilakukan analisis menggunakan ELISA reader. Standar pengujian kloramfenikol menurut regulasi dari US FDA adalah 0,3 ppb (R, Rindi, 2018).

Gambaran Umum Teknik ELISA

ELISA berasal dari singkatan bahasa Inggris yaitu Enzyme Linked Immunosorbent Assay. Teknik ELISA banyak digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen dalam sampel biologis. Sama seperti jenis immunoassay lainnya, teknis ELISA bergantung pada antibodi untuk mendeteksi antigen target menggunakan interaksi antibodi-antigen yang sangat spesifik.

Prinsip kerja ELISA kit CAP-E-FS-E044

Kit ini menggunakan Competitive-ELISA sebagai metode deteksi kuantitatif. Dapat mendeteksi Kloramfenikol (CAP) dalam sampel, seperti otot, susu, dll. Kit ini terdiri dari pelat Mikrotiter ELISA, konjugat HRP, larutan kerja antibodi, standar dan reagen tambahan lainnya. Pelat mikrotiter dalam kit ini telah dilapisi sebelumnya dengan antigen berpasangan. Selama reaksi, CAP dalam sampel atau standar bersaing dengan antigen berpasangan pada pendukung fase padat untuk mendapatkan lokasi antibodi anti-CAP. Kemudian konjugat Horseradish Peroxidase (HRP) ditambahkan ke setiap sumur pelat mikrotiter, dan ditambahkan reagen substrat untuk pengembangan warna. Terdapat korelasi negatif antara nilai OD sampel dengan konsentrasi CAP. Konsentrasi CAP dalam sampel dapat dihitung dengan membandingkan OD sampel dengan kurva standar (Elabscience user manual CAP ELISA Kit Cat.No.:E-FS-E044) (Elabscience, 2024).

Persiapan Bahan dan Alat

Bahan	Alat
1. CAP ELISA Kit Cat.No.:E-FS-E044 2. Sampel: Rajungan 3. Air Deionisasi 4. Etil asetat 5. N-heksan 6. Centrifuge tube 1.5ml 7. Tabung 10ml 8. Centrifuge tube 50ml 9. Gelas steril 10. Pipet Tips 1000uL, 200uL dan 10uL 11. Absorbent Paper	1. Microplate Reader 450nm 2. Sentrifugasi 3. Nitrogen Evaporator 4. Vortex 5. Mikropipet 6. Timbangan analitik

Tahap Preparasi

1. Mengencerkan 2×Rekonstitusi Buffer dengan air deionisasi. (2×Rekonstitusi Buffer (V):Air deionisasi (V) = 1:1)
2. Mengencerkan 20×Concentrated Wash Buffer dengan air deionisasi. (20×Concentrated Wash Buffer (V): Air deionisasi (V) =1:19).
3. Menyiapkan homogenat sampel dan ditimbang 3±0,05 g sampel homogenat masukkan ke dalam tabung centrifuge 50 mL, ditambahkan 3 mL air deionisasi dan aduk rata, kemudian tambahkan 6 mL Etil asetat dan vortex selama 2 menit. Centrifuge dengan kecepatan 4000 putaran/menit selama 10 menit pada suhu kamar.
4. Ambil 2 mL supernatan ke dalam tabung centrifuge lain, keringkan pada suhu 50-60℃ dengan evaporator nitrogen atau waterbath. (Silakan lakukan di lingkungan yang berventilasi.)
5. Larutkan residu dengan 1 mL N-heksana, tambahkan 0,5 mL Reconstitution Buffer (yang telah diencerkan) aduk rata selama 30 detik. Centrifuge dengan kecepatan 4000 putaran/menit selama 5 menit pada suhu kamar
6. Buang fase organik bagian atas, ambil 50 µL lapisan air bagian bawah untuk dianalisis.

Tahap Pengujian

1. Tambahkan 50 µL Standar (0 ppb, 0.025ppb, 0.075ppb, 0.225ppb, 0.675ppb, 2.025ppb) atau Sampel per sumur (secara duplo), lalu tambahkan 50 µL Larutan Working Antibodi, tutupi pelat dengan penyegel pelat. goyang selama 5 detik dengan lembut agar tercampur rata. Inkubasi pada suhu 25℃ selama 30 menit dalam gelap.
2. Cuci: buka sealer dengan hati-hati, buang cairan di setiap lubang. Segera tambahkan 300µL of Wash Buffer ke setiap sumur diamkan 30 detik. ulangi sebanyak 5 kali. Balikkan pelat dan tepuk-tepuk pada kertas penyerap tebal yang bersih (Jika ada gelembung di dalam lubang, ujung tip yang bersih dapat digunakan untuk menusuknya).
3. Tambahkan 100 µL konjugat HRP ke setiap sumur. Inkubasi pada suhu 25℃ selama 30 menit dalam gelap.
4. Cuci: ulangi langkah 2
5. Tambahkan 50 µL Reagen Substrat A ke setiap wadah, lalu tambahkan 50 µL Reagen Substrat B. Lakukan osilasi perlahan selama 5 detik agar tercampur rata. Inkubasi pada suhu 25℃ selama 15 menit.
6. Tambahkan 50 µL Stop Solution ke setiap sumur, tepuk perlahan hingga tercampur rata.
7. Segera lakukan pembacaan pada alat Microplate Reader untuk menentukan densitas optik (nilai OD) setiap sumur pada 450 nm (panjang gelombang referensi 630 nm).

Hasil dan Pembahasan

Sumuran	Sampel	Absorbansi
A1	standar 0	1.545
B1	standar 0.025	1.275
C1	standar 0.075	0.915
D1	standar 0.225	0.562
E1	standar 0.675	0.238
F1	standar 2.025	0.082
G1	sampel 1	1.407
H1	sampel 2	1.418
A2	sampel 3	1.661
B2	sampel 4	1.139

Nilai absorbansi kemudian dimasukkan ke program excel dan dihitung secara otomatis untuk membuat kurva standar dan mengetahui konsentrasi zat. Pada CAP ELISA kit ini nilai absorbansi rata-rata hitung kembali dengan perbandingan absorbansi standard 0 ppb. Absorbansi (%) = A/A₀ x 100%

A: Absorbansi rata-rata sampel atau standard

A₀: Absorbansi standard 0 ppb

Berikut hasil kurva standard yang didapatkan

  

<>	ODvalue-1	ODvalue-2	CV%	(A/A0)*100	Dilution factor	Concentration (ppb)
Sample1	1,407		0,0	91,1	0,5	0,008
Sample2	1,418		0,0	91,8	0,5	0,008
Sample3	1,661		0,0	107,5	0,5	0,004
Sample4	1,139		0,0	73,7	0,5	0,019

Didapatkan kurva standar kloramfenikol dengan nilai koefisien korelasi sebesar 0,991 menunjukkan korelasi tinggi. Berdasarkan hasil penghitungan, diperoleh konsentrasi kloramfenikol pada sampel 1 sebesar 0.008ppb, sampel 2 sebesar 0.008ppb, sampel 3 sebesar 0.004ppb dan sampel 4 sebesar 0.019ppb. Hal ini menunjukkan kloramfenikol yang terkandung dalam semua sampel masih dibawah batas maksimal dari yang ditetapkan, artinya produk aman untuk dikonsumsi dan dapat di ekspor. Batas maksimum konsentrasi kloramfenikol yang ditetapkan oleh SNI sesuai dengan SNI 01-6366-2000 kandungan kloramfenikol sebesar 0,01 mg/kg. sedangkan dibeberapa Negara seperti Uni Eropa (EU) dan Amerika Serikat (FDA) menetapkan batas maksimum residu kloramfenikol sebesar 0,3 µg/kg. Selain itu, negara lain seperti Rusia menetapkan batas residu kloramfenikol sebesar 0,5 unit/g, dan China sebesar 0,5 g/kg (Saputra dan Arfi, 2020).