Histamin adalah amina biogenik yang terbentuk melalui dekarboksilasi enzimatik dari asam amino histidin. Hal ini terjadi pada sel mast dan sel darah putih basofilik yang terikat pada heparin. Pada respons alergi tipe I, histamin endogenik dari sel mast dan leukosit basofilik dilepaskan setelah antigen mengikat IgE yang terkait membran, yang mengakibatkan reaksi alergi yang khas. Namun, histamin juga dapat masuk ke dalam tubuh manusia melalui makanan dan minuman yang tertelan dan dengan demikian dapat menyebabkan intoleransi makanan pseudo-alergi. Intoleransi makanan, yang disebabkan oleh peningkatan konsentrasi histamin, secara klinis ditandai dengan ruam, diare, muntah, mual, gatal, sakit kepala, dan asma. Tingkat reaksi bergantung pada jumlah histamin yang tertelan. Konsentrasi histamin yang toksik dapat timbul akibat penanganan yang tidak tepat atau rantai dingin yang terganggu. Zat-zat ini dapat menyebabkan apa yang disebut reaksi scombroid, yang muncul setelah degradasi bakteri pada makanan kaya protein, terutama ikan dari famili Scombridae. Badan Pengawas Obat dan Makanan AS telah menetapkan kadar tindakan sebesar 50 ppm untuk histamin pada ikan. Menurut Peraturan UE 2073/2005 dan amandemen selanjutnya, batas histamin pada ikan atau produk ikan adalah 100 ppm. Batas ini dinaikkan menjadi 200 ppm jika ikan atau produk ikan telah mengalami pematangan enzimatik dalam air garam. Dengan demikian, konsentrasi histamin pada ikan dan produk ikan harus dipantau (Hygiena, 2022).

Prinsip Kerja

Uji Histamin ELISA AlerTox didasarkan pada prinsip ELISA kompetitif kuantitatif. Konsentrasi histamin berbanding lurus dengan intensitas warna sampel uji. Berikut ini adalah ikhtisar singkat tentang uji ELISA kompetitif:

1. Konjugat histamin terikat pada permukaan pelat mikrotiter. Standar yang mengandung histamin yang diderivatisasi atau sampel uji dan antibodi yang ditujukan terhadap histamin (antibodi primer) ditambahkan ke sumur pelat mikrotiter. Histamin yang diimobilisasi dan bebas bersaing untuk tempat pengikatan antibodi. Setelah inkubasi 5 menit pada suhu ruangan, well dicuci dengan Wash Solution untuk menghilangkan bahan yang tidak terikat.
2. Antibodi sekunder yang dikonjugasikan dengan peroksidase yang ditujukan terhadap antibodi histamin ditambahkan ke dalam sumur, dan setelah inkubasi 5 menit lagi, pelat dicuci lagi.
3. Larutan substrat ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit, menghasilkan perkembangan warna biru. Penambahan stop solution menghambat perkembangan warna, dan warnanya berubah menjadi kuning. Warna kuning diukur secara fotometrik pada 450 nm (OD450).

Alat dan Bahan

1. Pipet: 10 – 100 µL, 100 – 1,000 µL 
2. Tip steril
3. centrifuge/ refrigerated centrifuge
4. homogenizer/ blender
5. ELISA Reader
6. Aquades
7. vortex (option)
8. paper towel
9. ELISA kit Histamin [AlerTox® ELISA Histamine]

Cara Kerja

1) Persiapan Reagen

melarutkan 10X Washing Buffer 1:10 dengan aquades. jadilah 1X Washing Buffer -> dibuat 2 resep untuk 2 kali pencucian atau buat sesuai dengan kebiasaan sehari-hari.

2) Persiapan Standar (Derivatisasi)

1. Pindahkan 500 μL setiap standar ke dalam tabung terpisah dan tambahkan 25 μL Reaction Solution ke setiap standar. Campur hingga merata dan inkubasi selama 1 menit.
2. Tambahkan 100 μL Larutan Netralisasi ke standar yang diaktifkan. Campur hingga merata dan inkubasi selama 1 menit. Standar siap digunakan

Gambar 1. persiapan Standar

3) Persiapan Sampel

1. Homogenkan 10 g sampel ikan dalam 100 mL aquades
2. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 4°C (Note: Langkah ini dapat dilewati jika langkah 3 dilakukan dengan sentrifus pada suhu 4°C (39 °F)
3. Sentrifus minimal 3.000 x g selama minimal 10 menit.
4. Ambil 100 μL supernatan (dibawah lapisan lemak), pindahkan ke tabung baru, tambahkan 900 μL Sample Dilution Buffer, tambahkan 50 μL Reaction Solution. homogenkan, inkubasi 1 menit di suhu ruang.

–> atau saring terlebih dahulu dengan kertas saring utk memisahkan lemak & debris sel, hasil saringan ditambahkan 900 μL Sample Dilution Buffer, ditambahkan 50 μL Reaction Solution. homogenkan, inkubasi 1 menit di suhu ruang.

5. Tambahkan 100 μL Neutralizing Solution
6. homogenkan, inkubasi 1 menit di suhu ruang, sampel siap diuji

Gambar 2. persiapan sampel

4) Pengujian ELISA

1. Tambahkan 100 μL Standar (yg telah di derivatisasi) dan sampel pada masing-masing sumur sesuai desain. (dianjurkan untuk melakukan nya secara duplo) 
2. tambahkan 50 μL Anti-Histamine Antibody pada setiap sumuran
3. inkubasi 5 menit suhu ruang
4. Cuci pelat sebanyak tiga kali dengan 300 µL 1X Washing Buffer
5. tambahkan 100 μL Conjugate Solution di setiap sumuran
6. inkubasi 5 menit suhu ruang
7. Cuci kembali seperti langkah 4
8. tambahkan 100 μL Substrate Solution pada tiap sumur
9. inkubasi 5 menit pada ruang gelap suhu ruang
10. tambahkan 100 μL Stop Solution untuk menghentikan reaksi
11. tepuk-tepuk perlahan dan lakukan pembacaan pada ELISA Reader (OD450 nm)

Gambar 3. Pengujian ELISA

Hasil pengujian menggunakan kit ini, sama dengan kit existing yang biasa digunakan. Bisa jadi ada beberapa penyesuaian dengan pengerjaan sehari-hari oleh user, tapi tidak masalah.

-AI-