The 8th Molecular Cell Culture (MCC VIII) 2024
“Workshop Series on Molecular and Cell Culture” ITD Universitas Airlangga
Kultur sel merupakan salah satu cabang dari ilmu biologi molekuler. Kultur sel adalah kultur yang diperoleh dari sel-sel yang diuraikan secara enzimatis, mekanis atau kimiawi dan dapat juga berasal dari kultur primer (Freshney, 1994). Umumnya, teknis kultur sel juga digunakan untuk mempelajari perilaku sel secara invitro (Puspitasari dkk., 2008).
Sel Vero umum digunakan dalam penelitian biologi molekuler dan banyak digunakan untuk mempelajari virus, pengobatan, dan vaksin. Dikembangkan pada tahun 1962 oleh Yasumura dan Kawakita di Universitas Chiba di Jepang, sel Vero berasal dari monyet hijau Afrika dewasa betina (GenoFAB, Inc, 2023). Kultur sel Vero telah umum dilakukan karena penggunaannya yang telah disetujui dan direkomendasikan oleh WHO karena keamanannya untuk produksi vaksin virus manusia (WHO, 1998).
Aplikasi yang lebih mutakhir bergantung pada kurangnya produksi interferon pada sel Vero, yang membuat mereka rentan terhadap infeksi oleh banyak virus, sehingga menjadikannya kandidat utama untuk produksi virus dan pengujian efek obat antivirus pada replikasi virus. Secara analog, sel Vero sering digunakan untuk memproduksi vaksin yang sering bergantung pada partikel atau protein virus. Selain untuk menguji terapi, sel Vero juga dapat digunakan untuk mengukur konsentrasi virus sebagai dosis infeksius melalui uji plak. Di sini, cawan kultur yang berisi sel Vero diperlakukan dengan larutan yang mengandung virus yang semakin encer yang akan melisiskan sel dan menciptakan plak yang dapat dihitung (GenoFAB, Inc, 2023).
Workshop kali bertujuan Mengembangkan pengetahuan dan meningkatkan kualitas dalam bidang teknik biologi molekuler serta Memberikan pelatihan hands-on bagi para peserta tentang teknik kultur sel.
Workshop diadakan pada tanggal 13 November 2024 mulai pukul 09.00-16.00 WIB di ruang penyuluhan lantai 2 Institut Tropical Disease Universitas Airlangga, sedangkan Hands-on atau demo prosedur kultur sel dilakukan di lab Dengue ITD Unair.
Alat dan Bahan
| 37°C, 5% CO2 incubator | 15 mL centrifuge tube, Cryotube | [PM150210] DMEM (High glucose) Elabscience | Sel Vero |
| Safety cabinet (BSC) | Disposable pipette (5mL and 10mL) | [FSS050] FBS (Fetal Bovine Serum) Excell Bio | counter |
| Centrifuge (with rotor for 15mL tube) | T-25 flask | 0.25% Trypsin Solution, with EDTA, phenol red, dissolved in PBS [PB180229] Elabscience | Freezing Medium (Serum-free & animal origin-free) [PB180438] Elabscience |
| Autopipettor | Micropipette | DMSO | cover slip/ cover glass |
| Waterbath | Microscope Inverter | 0.4% Trypan blue stain | Haemocytometer |
Tahapan pada kultur sel meliputi beberapa metode sebagai berikut
- THAWING/ RECOVERY SEL
- Hangatkan medium dengan waterbath sampai mencapai suhu 37°C.
- sambil menunggu, mulai sterilisasi BSC dengan UV light selama 10 menit kemudian dengan etanol 70%.
- Siapkan semua alat & bahan kedalam BSC (medium, autopipettor, T-25 Flask, dan wadah sampah)
- Siapkan 10 ml medium (DMEM) di centrifuge tube dan 4 ml medium di flask T25.
- Ambil sel stok yang akan digunakan untuk recovery.
- Cairkan sel dengan panas tubuh (genggaman tangan).
- Setelah sel stok mencair, dimasukkan medium 10ml kedalam tube.
- Sentrifuge selama 5 menit 2000 rpm (jangan terlalu lama agar tidak terlalu menggumpal)
- Supernatan dibuang, lalu ditambahkan 1 ml medium ke pellet.
- Pipet naik turun (resuspen sebanyak 20 kali) agar sel merata dan homogen.
- Masukan kedalam flask T25, lalu ditambahkan medium.
- Amati sel dengan mikroskop dan pastikan sel merata (tidak menggumpal).
- Letakkan sel kedalam inkubator 37°C, 5% CO2.
Gambar 2. Hasil sentrifugasi medium & sel stock
- FREEZING SEL
- Ambil medium baru dari kulkas
- Tambahkan DMSO dan campurkan hingga merata dengan membolak balikkan tube, lalu diamkan media dalam es.
- Hangatkan trypsine EDTA dengan waterbath
- Ambil sel yang akan dipassage dan buang medium yang lama. [Catatan: Gunakan sel yang 80% confluence atau lebih, jangan menggunakan sel yang over-growth.]
- Bilas medium dengan 2 mL 0.25% Trypsine EDTA.
- Tambahkan 2 mL 0.25% Trypsine EDTA.
- Masukkan flask dalam inkubator 37°C sampai monolayer lepas menjadi sel tunggal ± 3 menit.
- Amati sel dengan mikroskop dan pastikan monolayer sudah menjadi sel tunggal.
- Tambahkan 2 ml Freezing Medium PB180438. resuspensi sel naik turun (20 kali) dengan pipet agar homogen .
- Ambil sel dan masukkan sejumlah ke tiap cryotube yg sudah disiapkan
- Letakkan sel kedalam freezer -80°C.
Gambar 3. Pengamatan sel dibawah mikroskop inverter
- MENGHITUNG SEL
- Pastikan hemositometer dan coverslip bersih. Gunakan alkohol jika belum bersih. Pasang cover slip di hemasitometer.
- Siapkan suspensi sel dan campurkan dengan 0.4% trypan blue stain di vial dengan perbandingan 1:1. Contoh 100 μl sel dan 100 μl 0.4% trypan blue stain. Catatan: jika diperlukan sel dapat didilusi terlebih dahulu sebelum dicampur dengan 0.4% trypan blue stain.
- Pipet sel mix (± 10 μl) di tepi coverslip dan biarkan mengalir dibawah coverslip.
- Lihat hemositometer grid di bawah mikroskop. [grid hemositometer dilihat dengan mikroskop. Empat kotak besar di pojok adalah lokasi untuk menghitung sel]
- Hitung sel yang hidup dan yang mati. Catatan: Sangat direkomendasikan untuk menghitung 40 – 70 sel untuk mendapatkan data yang akurat. Maka dari itu menghitung lebih dari satu kotak mungkin diperlukan. Cara menghitung sel dapat dilihat pada gambar 5.
- Hitung konsentrasi sel dengan rumus berikut:
Gambar 4. penampakan hemositometer
Gambar 5: sistem perhitungan sel untuk memastikan akurasi dan konsistensi. Sel yang dihitung adalah sel yang terdapat di dalam kotak besar. Selain itu sel yang meliwati batas di 2 dari 4 sisi kotak besar juga dihitung selama sel masih menyentuh garis 4 tengah. Contoh diatas menunjukkan bulatan-bulatan kecil adalah sel, warna hijau menandakan sel ikut dihitung dan warna merah berarti sel tidak dihitung
- PASSAGE SEL VERO
- Hangatkan medium dengan waterbath sampai mencapai suhu 37°C.
- Ambil sel yang akan dipassage dan buang medium yang lama. [Catatan: Gunakan sel yang 80% confluence atau lebih, jangan menggunakan sel yang over-growth.]
- Bilas medium dengan 2 mL PBS.
- Tambahkan 2 mL 0.25% Trypsine EDTA.
- Masukkan flask dalam inkubator 37°C sampai monolayer lepas menjadi sel tunggal ± 2 menit.
- Amati sel dengan mikroskop dan pastikan monolayer sudah menjadi sel tunggal.
- Tambahkan 2 ml medium.
- Pipet suspensi sel naik turun agar homogen.
- Siapkan wadah baru untuk kultur.
- Ambil sel dan inokulasikan ke flask yang baru (vol medium disesuaikan dengan wadah baru
- Letakkan sel dalam inkubator 37 °C, 5% CO2.
Gambar 6. subkultur/ passage sel vero ke flask baru
- INOKULASI VIRUS DENGUE
- Siapkan sel vero di 96 well plates.
- Masukkan sel kedalam inkubator 37°C, 5% CO2 sampai sel mencapai 80% confluence atau monolayer (± 1-2 hari).
- Untuk inokulasi primer maka siapkan dilusi spesimen 11x yaitu 5 μl dalam 60 μl medium per well. Untuk blind passage maka siapkan kultur lama yang akan di passage.
- Buang medium sel vero yang lama.
- Pindahkan 50 µl sample ke sel vero.
- Goyangkan plate dengan tangan agar campuran di plate merata.
- Inkubasi plate di 37°C, 5% CO2 selama 1 jam. Catatan: Goyangkan plate setiap 15 menit sekali.
- Tambahkan 50 μl medium baru.
- Inkubasi plate di 37°C, 5% CO2 selama 3-4 hari.
- Amati sel dibawah mikroskop setiap hari untuk mengetahui CPE.
Gambar 7. Inokulasi virus ke sel vero
informasi lebih lanjut silahkan hubungi kami +62 812-1704-2657
